بررسی مقایسهای ویژگیها و توانایی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان بافت چربی و مایع آمنیوتیک به سلولهای فیبر عدسی چشم

مقاله پژوهشي مجله سلول و بافت )علمي - پژوهشي( جلد 5 شماره 1 بهار 11-22 1191 بررسی مقایسهای ویژگیها و توانایی تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان بافت چربی و مایع آمنیوتیک به سلولهای فیبر عدسی چشم 3 3 2 * 1 هما محسنی کوچصفهانی Ph.D. محمد نبیونی Ph.D. نسیم اسالمی MD. خدیجه بهره بر MD. 3 پریسا غیبی MD. 1- زیست شناسی تکوینی دانشگاه خوارزمی تهران دانشکده علوم زیستی گروه علوم جانوري ۲- زیست شناسی تکوینی استادیار دانشگاه خوارزمی تهران دانشکده علوم زیستی گروه سلولی و مولکولی ٣- کارشناسی ارشد زیست شناسی تکوینی دانشگاه خوارزمی تهران دانشکده علوم زیستی گروه علوم جانوري * پست الکترونيك نویسنده مسئول: kouchesfehani@yahoo.com تاريخ دريافت: 3133/31/31 تاريخ پذيرش: 3134/31/42 چکیده هدف: در اين مطالعه اثر تمايزی مايع زجاجیه بر سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای شبه فیبر عدسی چشم مورد بررسی قرار گرفته است. مشتق شده از مغز استخوان بافت چربی و مايع آمنیوتیک موادو روشها: در اين کار تجربی سلولهای بنیادی از مغز استخوان ران و چربی از ناحیه کشااله ران ماوش هاای باال NMRI و ماايع آمنیوتیک از جنینهای 31 روزه موشهای NMRI جدا شده و کشت داده شد. مزانشیمی بودن سالولهاا باا مارکرهاای ساطییCD31 و CD90 به روش فلوسیتومتری بررسی شد. سپس سلولها تیت القای زجاجیه چشم گاو باه ماد 32 روز باا دردادهای مختلا 31 21 11 41 33 و 31 قرار گرفتند. بیان مارکرهای آلفا کريستالین در نمونههای تجربی و کنترل با روش ايمونوسیتوشیمی ماورد بررسای قرار گرفت. نتایج: آنالیز فلوسايتومتری مارکرهای سطیی نشان داد که سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان و ماايع آمنیوتیاک و بافات چربای مارکرCD90 را )بهترتیب 43/43 دردد 1/35 دردد 24 دردد( بیان میکنند. بهعالوه سلول بنیادی مزانشیمی از هر ساه منباع ماارکر CD31 )بهترتیب 1/22 دردد 3/31 دردد 1/3 دردد( بیان میکنند. بررسیهای ايمونوسیتوشیمی نشان داد کاه غلظات 21 درداد از مايع زجاجیه بر روی سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی و مايع آمنیوتیک و غلظت 33 دردد از مايع زجاجیه بر روی سلولهای مغز استخوان نسبت به ساير غلظتها اثر القايی بیشتری دارد. نتیجهگیری: بر اساس يافتههای اين مطالعه سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از هر سه منبع در اثر عمل القاايی ماايع زجاجیاه میتوانند به سلولهای فیبر عدسی چشم تمايز يابند. واژگان کلیدی: سلولهای بنیادی مزانشیمی زجاجیه کريستالین 11

مقدمه سلولهای بنیادی سلولهای تمايز نیافتهای هستند کاه تواناايی تبديل و تمايز به انواع مختلا سالولهاا را دارناد. سالولهاای بنیادی دارای دو ويژگی مهم هستند که سلولهای بنیاادی را از ساير سلولها متمايز مایکنناد. ايان سالولهاا تواناايی تثيیار نامیدود دارند و در حالت متمايز نشده باقی میمانند. عاالوه بار اين سلولهای بنیادی چنانچه در شرايط مییطی مناساب قارار بگیرند قادرند به سلولهای مورد نظر تبديل شاوند. سالولهاای بنیادی مایتوانناد تیات تااثیر بعضای شارايط فیزيولوكياک ياا آزمايشگاهی به سلولهايی باا عمالکردهاای اتتاادای مانناد سلولهای عضالنی قلب يا سالولهاای تولیدکنناده انساولین در پانثراس تبديل شوند )3(. سلولهای بنیادی از لیاظ منشا به دو دسته عمده سلولهای بنیادی جنینی و سلولهای بنیادی باال تقسیم میشوند )4(. سلوله یا بنیادی بال در بسیاری از بافتها و اندامها شامل مغز مغازاساتخوان ماهیچاهاساثلتی شابثیه قرنیه چشم پالپ دندان مغز طناب عابی کبد بافات چربای پوست و روده وجود دارند )1(. از مهمترين سالولهاای بنیاادی بال سلولهای بنیادی مزانشیمی میباشند سلولهاای بنیاادی مزانشایمی بارای اولاین باار در مغاز اساتخوان در ساال 3311 شناسايی شدند )2(. در سالهای اتیر مهمترين منبع سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان بوده است اما سلولهای بنیادی مزانشیمی را از منابع ديگر ميال بافات چربای تاون بناد ناا غشای آمنیوتیک پولپ دندان تون مییطی بافات پريوسات و ماهیچه اسثلتی نیز جدا کردهاناد )3 و 1 (. مغاز اساتخوان منباع ادلی دو نوع از سلولهاای بنیاادی باهناام سالولهاای بنیاادی تونساز و سلولهای بنیادی مزانشیمی میباشد )5(. مايع زجاجیه مايعی شفا است که از جام بینايی منشا میگیرد و فضای پشت عدسی چشم را پر کرده است و در مسیر تماايزی عدسی چشم نقش ويژه دارد. در زجاجیه کنادروايتین ساولفا هپاران سولفا و اسیدهیالورونیک وجود دارند. اسید هیالورونیک تمايل بااليی برای جذب آب داشاته ودر نتیجاه 33 درداد وزن زجاجیه را آب تشثیل میدهد و بدين سبب اساید هیالورونیاک يک حالت كلهای به زجاجیه میدهد )2(. مهمتارين فاکتورهاای موجود در مايع زجاجیه فاکتورهای رشاد فیبروبالساتی) )FGF FGF-1 و FGF-4 میباشاد )3(. مطالعاا تجربای نشاان داده است کاه ايان فااکتورهاا در میایط کشات باعاق القاا و تماايز سلولهای بنیادی به سلولهای عدسی میشود و همچنین باعق بیان كنهای کريستالین طويل شدن و تخاص ياابی سااتتاری در سلولهای فیبری میگردند )31(. شواهد نشان مایدهاد کاه سلولهای بافات پوششای عدسای تیات القاا FGF در میایط کشت تمايز پیدا کرده و ساتتار مولثولی و مورفولوكی فیبرهاای عدسی را کسب کردهاند )33(. عمدهترين پروتئینهای سلولهای فیبار عدسای کريساتالینهاا میباشند )34( که به دوگروه عمده α وβ تقسیم میشوند )31(. با افزايش سن مشثال و بیماریهای چشمی بهويژه پیرچشامی و آب مرواريد در جوامع مختلا رو باه افازايش اسات. بناابراين امروزه استفاده از سلولهای بنیاادی بعناوان ياک راهثاار بارای ترمیم و يا جايگزينی سلولهای عدسی و شبثیه ضروری بهنظار میرسد )32(. در اين میان سلولهای بنیادی مزانشیمی بهدلیل دارا بودن تادیت تودتجديدی و توان تمايز به ساير سلولهاای ديگر بهعنوان يک منبع مناسب و يک استراتژی برای جاايگزينی ضايعا سلولی و كن درمانی میسوب میشود )33(. مواد و روشها جداسازی و کشت سلولهای مزانشیمی مغز استخوان: در اين تیقیق تجربی موشهای نژاد NMRI با سن تقريبی 2 تاا 1 هفتاه باا روش جاباهجا ای مهارههاای گردنای (cervical dislocation) بر اسااس پروتوکال داادره از کمیتاهی اتالقای دانشا گاه تا وارزمی کشا ته شا دند. در شارايط کا امال اساتريل استخوانهای ران و درشت نی جدا داتل مییط DMEM قرار داده و به زير هود منتقل شدند. دو سر استخوان باا ياک قیچای کامال استريل بريده شده و مغز استخوان از داتل کانال استخوان با استفاده از سرنگ حاوی مییط DMEM و عمال Flushing تارج شد. مغز اساتخوان در فاالثون 33 میلایلیتاری ريختاه و سانتريفیوك شد تا رسوب سلولی تشثیل شود. سپس مییط رويی تخلیه و سلولها در 4 میلیلیتر مییط کشت تاازه معلاق شادند. مییط مورد استفاده Dubleco,s modified eagles ( DMEM Fetal ( FBS حاوی 33 دردد )medium; Gibco Germany )Bovine Serum;Gibco,Germany و 311 واحاد باینالمللای پناایساایلین )Gibco,Germany( و 311 واحااد بااین المللاای استرپتومايسین )Gibco,Germany( بود. سالولهاا حادال در فالسک 43 سانتی متری کشت داده شدند. مییط سلولها هر 1 روز يکبار به مد دو هفته تعويض شد. 12

جداسازی و کشت سلولهای مزانشیمی بافت چربیی: در اين تیقیق تجربی موشهای نژاد NMRI با سن تقريبی 2 تا 1 هفته با روش جابهجای مهارههاای گردنای کشاته و ساپس باا استفاده از الثل 51 دردد ضدعفونی شدند. بافت چربی از ناحیه پشات کشااله ران ماوشهاا جادا شاده و در میلاول اساتريل )PBS( phosphate-buffered saline تیاات شستشااو قاارار گرفت. سپس قطعا چربی به دور مثانیثی باا قیچای از هام جدا شدند و به قطعا دو میلیمتری درآمدند. تمامی مراحل باال بر روی يخ انجام گرفت. سپس تمامی PBS مییط کشیده شد و تثههای چربای تیات تااثیر 1/153 کالكنااز ناوع (Merck) I در PBS بهمد چهل و پنج دقیقه در انثوباتور با دماای 15 درجاه سانتیگراد و Co 4 3 دردد قرار گرفتند با اين تودی کاه هار پنج دقیقه يکبار مواد داتل فالثون پیپتاك شد. سپس کالكناز باا PBS تنيی گرديد )با اضافه کردن 3/3 میلیلیتار PBS رقات کالكناز آنقدر زياد شد که فعالیت اولیاهی تاود را از دسات داد وتنيی گرديد( و سپس فالثون در داتل سانتريفیوك بهماد دقیقه با دورg 31 3411 قرار گرفت. پس از اتمام ساانتريفیوك ماايع رويی که حاوی تثههاای چربای باود دور ريختاه شاد و رساوب سلولی با PBS شستشو داده شد و دوباره در سانتريفیوك باا دور 3311rpm بهمد 3 دقیقه قرار گرفت. پس از ايانکاه دوبااره مايع رويی حذ شد مییط کشت DMEM بههمراه 33 FBS دردد و آنتیبیوتیکهای پنیسیلین و استرپتومايسین به نسابت 3 به 311 به رسوب سلولی اضافه شد و در فالسک 43 سانتیمتر مربع بدون پوشش با درب فیلتردار کشت داده شاد و هار 4 روز يثبار تعويض مییط دور گرفت. جداسازی و کشت سلولهای مزانشیمی مایع آمنیوتیی:: موشهای NMRI در هفتاه دوم باارداری باهروش جاباهجاای مهرههای گردنی کشته شدند و جناین آنهاا تاارج و در ظار حاوی HBSS قرار داده شد. سپس مايع آمنیوتیک احاطه کننده جنین بهکمک پیپت پاستور کشیده شاد. کلیاه ايان مراحال در مییط استريل انجام شد. اين مايع بههمراه 3 میلیلیتار میایط کشت 41FBS DMEM دردد و آنتایبیوتیاک پنایسایلین و استرپتومايسین در فالسک 43 سانتیمتر مثعب در شرايط عادی کشت سلولی در داتل انثوباتور در دمای 15 درجه سانتیگراد و فشار Co 4 3 دردد کشت داده شد. اولین تعويض میایط در روز 4 و پس از آن تعويض مییط هر سه روز يثبار انجام شد. نحیوه گرفتن مایع زجاجیه: در ايان پاژوهش چشمهاای گااو گرفته شده ازکشتارگاه کرج در PBS به آزمايشگاه منتقل شاد و با آنتیبیوتیاک پنایسایلین و استرپتومايساین هماراه باا PBS استريل گرديد. با فروکردن سر سرنگ 31 گارم از ناحیاه پشاتی چشم مايع زجاجیه بیرون کشیده شد و در دستگاه سانتريفیوك با دور 32111 rpm بااهمااد 41 دقیقااه در دمااای 2 درجااه سانتیگراد قرار گرفت. مايع رويی فیلتر گرديد و در فريازر 21- درجه سانتیگراد نگهداری شد. بررسی بیان مارکرهای سطحی بیه روش فلوسییتومتری: سالولهاای حادال بعاد از تريپساینه و ساانتريفیوك کاردن در اپندور ريخته و با PBS شسته شدند. سپس بهمد 31 دقیقه باا دور rpm 4111 ساانتريفیوك شادند. آنتایباادیهاای اولیاه CD90 کونژوگاه باا PE )فیثاواريترين( وکونژوگاه CD31 باا FITC )فلورسنس ايزوتیوسیانا ) اضافه شد و بهمد 11 دقیقه در يخچاااال قااارار گرفااات و بااارای کنتااارل منفااای از آنتیبادیهاای PE-IgG2a, FITC- IgG2b اساتفاده شاد. در مرحله بعد سلولها پس از شستشو با PBS به مد دور 4111 31 دقیقه با rpm سانتريفیوك شادند. ساپس باه سالولهاا باافر فا یثس کننا ده فرما الین 3 دردااد اضا افه شا د و با ا دسااتگاه فلوساایتومتری,Germany( )Beckton Dickinson آنااالیز شدند. تیمار سلولهای جداشده با مایع زجاجیه: پس از پاساك سوم سلولها بعد از شامارش سالولی باه تعاداد 31 2 2 سالول در 5 تانهی پلیت 42 تانهای کشت داده شدند و پاس از چسابیدن سلولها به ک ظر گروههای تجربی با درددهای مختل 31 21 11 41 33 و 31 از مايع زجاجیه در میایط کشات تیماار شدند و گروه کنترل بادون تیماار باا ماايع زجاجیاه و دارفا باا DMEM و 33 FBS دردد و آنتیبیوتیکها کشت داده شدند. اين تانهها بهمد 32 روز تیت تیمار و کشت قرار گرفتند. رنگآمیزی سلولها با مارکر کریستالین: در انتهاای روز 32 نمونههاای تجربای و نموناههاای کنتارل باا آنتایباادی اولیاه کريساتالین alpha A+ alpha B crystalline antibody (anti-rabbit- IgG- AF8035) و آنتیبادی ثانويه (ab28163) fitc رنگآمیزی شدند. بهمنظور انجام ارزيابی ايمونوسیتوشیمی سا لولها ای مزانشا یمی تیما ار شاده باهماد 33 دقیقاه با ا پارافرمالدئید 2 دردد در دمای اتاق تيبیت شدند. سپس با PBS شستشو و از بافر بالک کننده حاوی 100-X Triton جهت نفوذ پذيری سلولها برای ورود آنتیبادی استفاده شد. ساپس Goat 11

Goat serum اضااافه شااد و پااس از تااارج کااردن serum آنتیباادی اولیاه alpha A+ alpha B crystalline antibody رقیق شاده در Phosphate Buffered Saline ( BSA/PBST albumin/tween-20 )Bovine serum 1/4 درداد اضاافه شد و سلولها در اين میلول به مد 23 دقیقه در انثوبااتور 15 درجه سانتیگراد انثوبه شدند. نمونهها 4 باار باا PBS/Tween 1/3 دردد شستشو داده شدند. آنتیبادی ثانويه رقیاق شاده در 1/4 BSA/PBST دردد باهماد 11 دقیقاه در دماای اتااق اضافه شد. از میثروسثوپ معثاوس فلورساانس جهات ارزياابی سلولها استفاده شد. نتایج مورفولوژی سلولهای کشت شده در کشت اولیه سلولهای گرفته شده از مغز استخوان موشهای NMRI به شثل گروههای سلولی ناهمگن و هتروكن ديده شدند )شثل 3A(. در روز هفتم سلولها با مورفولوكی متفااو نظیار پهان دوکای و چناد وجهای مشااهده شادند )شاثل 3B(. در پ سا اكهای بعدی تعداد سلولهاای دوکای شاثل بیشاتر شادند بهطوریکه در پاساك سوم اکيريت سلولها دوکی شثل بودند. در ادامه پاساكهای بعدی سلولهای بنیاادی مزانشایمی باهداور تاالص در آماده بودناد و سالولهاای مزانشایمی از لیااظ مورفولوكيثی بیشتر شبیه به سالولهاای فیبروبالسات )دوکای شثل( بودند. سلولهای بنیادی بافت چربی بعد از کشات اولیاه در زيا ر میثروسا ثوپ معثا وس با هدا ور سا لولها ای شاابه فیبروبالستی همراه با زوائد کوچثی در اطرا روئیت شادند کاه به ظر کشت چسبیده بودند و سلولهای مرده بهدور اجسام شفا در سطح کشت نماياان بودناد )شاثل 4A(. بعاد از ياک هفته تعداد سلولهای مزانشیمی بافت چربای کاه دوکای شاده بودند افزايش يافت )شثل 4B(. سلولهاای ماايع آمنیوتیاک در روز اول کشت شامل جمعیت هتروكنی از سلولها بودناد. در روز دوم میاایط کشاات شااامل جمعیتاای از ساالولهااای بنیااادی مزانشیمی چسبیده به کا ظار باا مورفولاوكی فیبروبالساتی بههمراه گروهی از سلولهای غیر مزانشیمی شناور بودند )شاثل 1A(. سلولهاای بنیاادی مزانشایمی چسابیده باه کا ظار بهسرعت تثيیر شدند و ظر يک هفته به دور يک تاک الياه ک ظر را پر کردند )شثل 1B(. A B شثل 3: کشت سلولهای مغز استخوان گرفته شده از موش. )A( در روز اول کشت سلولهای مزانشیمی و غیر مزانشیمی به شثل ناهمگن ديده شدند. )B( در روز هفتم سلولهای مزانشیمی بیشتر بهدور دوکی شثل مشاهده شدند. )میثروسثوپ فاز کنتراست معثوس با بزرگنمايی 211(. A B شثل 4: کشت اولیه سلولهای بنیادی جدا شده از بافت چربی) A ( و کشت سلولها بعد از يک هفته )B(. )بزرگنمايی 211(. 11

A B شثل 1: جمعیت هتروكن سلولهای کشت داده شده مايع آمنیوتیک در روز دوم )A( و سلولهای بنیادی مزانشیمی مايع آمنیوتیک در روز هفتم) B (. )بزرگنمايی 211(. سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان در غلظت 31 درداد شباهت بسیاری به گروه کنترل )بدون مايع زجاجیه( داشتند در حالیکه در غلظت 33 دردد سلولها کشایده تار و باه داور موضاعی باهماوازا هام آراياش يافتاه بودناد و پاس از آن در غلظتهای 21 و 11 41 31 دردد میزان مرگ و میر سلولهاا بسیار زياد گرديد و آرايش سلولی از بین رفت. گروههای تجربای سلولهای بنیادی مزانشیمی مايع آمنیوتیک در غلظت 33 31 41 و 11 دردد شباهت بسیاری به گاروه کنتارل داشاتند در حالیکه در غلظت 21 دردد سلولها کشیدهتر و بهماوازا هام آرايش يافته و دارای هستکهای بیشتری در داتل هسته بودند و پس از آن در غلظت 31 دردد میازان مارگ و میار سالولهاا بسیار زياد گرديد و آرايش سالولی از باین رفات. روناد اتیار در مورد سلولهای مزانشیمی چربی نیز دقیقا بههمین دور باوده و افزايش تعداد هستکهای داتل هسته و موازی بودن سلولهاا بهدور موضعی در غلظت 21 دردد حاکی از تاثیر زجاجیه بار سلولهای بنیادی و القا هدفمند آن داشته است )شثل 3 (. نتایج بهدست آمده از بررسی بییان مارکرهیای سیطحی بهروش فلوسیتومتری جهت اثبا ماهیت مزانشایمی باودن ايان سالولهاا عاالوه بار تادیت چسبندگی آنها به ظر کشت يثای ديگار از راههاای شناسايی آنها استفاده از مارکر سطیی میباشد که بعد از پاساك اول و جداشدن سلولهای بنیادی مزانشایمی از سااير سالولهاا بهروش فلوسیتومتری بررسی شاد. در ايان بررسای سالولهاای بنیادی مزانشیمی هر سه منباع باا دو ماارکر CD90 و CD31 بررسی شدند. نتايج در مورد مارکرCD90 بار روی سالولهاای بنیادی مزانشیمی مغاز اساتخوان و ماايع آمنیوتیاک باهترتیاب 43/43 دردد و 1/35 دردد بوده است )شثل 2( در حاالیکاه سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی اين ماارکر را باهمیازان 24 دردد بیان کردند )شثل 2(. در مورد ماارکر CD31 هار سه منبع سلولهای بنیاادی آن را باهمیازان کام بیاان کردناد. همانطور که در شثل 2 ديده میشاود بافاتهاای چربای مغاز استخوان و مايع آمنیوتیک مارکر CD31 را بهترتیب 1/3 دردد 1/22 دردد 3/31 دردد بیان میکنند. نتایج حاصل از بررسی مورفولوژی سلولها در طی تمایز پس از پاساك سوم سلولهای بنیادی مزانشایمی مشاتق شاده از مغز استخوان بافت چربی و مايع آمنیوتیک تیت القا درددهای مختل 21 41 11 33 31 و 31 از ماايع زجاجیاه نسابت باه مییط کشت بهمد 32 روز قارار گرفتناد. گاروههاای تجربای 15

A B C D E F شثل 2: نتايج فلوسیتومتری برای A: سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان که مارکر سطیی CD31 را 1/22 درداد بیاان کردناد. B: سالولهاای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان که مارکر سطییCD90 را 43/43 دردد بیان کردند. C: سلولهای بنیادی مزانشیمی مايع آمنیوتیک که مارکر ساطیی CD31 را 3/31 دردد بیان کردند. D: سلولهای بنیاادی مزانشایمی ماايع آمنیوتیاک کاه ماارکر ساطیی E: را 1/35 درداد بیاان کردناد. CD90 سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی که مارکر سطیی CD31 را 1/3 دردد بیان کردند. F: سلولهاای بنیاادی مزانشایمی بافات چربای کاه ماارکر سطیی CD90 را 24 دردد بیان کردند. 11

A B C D شثل 3 : )A(: سلولهای بنیادی مزانشیمی در گروه کنترل است که پس از 32 روز کشت بدون مجاور با مايع زجاجیه عالئمی از کشیدگی سالولی در آنها ديده نمیشود. )B(: سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی پس از 32 روز کشت با غلظت 21 دردد مايع زجاجیه که سلولهاا نسابت باه گاروه کنترل کشیدهتر شدهاند. )C( سلولهای بنیادی مزانشیمی مايع آمنیوتیک پس از 32 روز کشت با غلظت 21 درداد ماايع زجاجیاه نسابت باه میایط کشت که سلولها نسبت به گروه کنترل کشیدهتر شدهاند. )D( سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان پاس از 32 روز کشات باا غلظات 33 درداد مايع زجاجیه نسبت به مییط کشت که سلولها نسبت به گروه کنترل کشیدهتر شدهاند. در هر سه نمونه B,C و D سلولهای تیماار شاده کشایدهتار و فیبری شثل شده اند و بهسمت آرايش موازی پیش میروند. )بزرگنمايی 211x( نتایج بررسی بیان مارکرهای آلفا کریستالین بهروش ایمونوسیتوشیمی نتايج بررسیهای ايمونوسیتوشیمی سالولهاای گاروه تجربای و گروه کنتارل باا آنتایباادی پلایکلوناال alpha +A alpha B crystalline antibody پاااس از 32 روز نشاااان داد کاااه در سالولها ای بنیا ادی مزانشا یمی مغا ز اسا تخوان میا زان بیا ان کريستالین در سلولهای تیمار شده باا غلظات 33 درداد ماايع زجاجیه نسبت به ساير غلظتهاای ماايع زجاجیاه بیشاتر باود چنانچه در غلظت 31 دردد فقط تعداد کمی از سالولهاا رناگ پذيرفته بودند و در غلظتهای ديگر مارگ و میار سالولی ماانع رنگ گیری شده و اثری بر دفیه مشاهده نشاد. در سالولهاای تیمار شده بافت چربی و مايع آمنیوتیاک باا غلظات 21 درداد نسبت به ساير غلظتهای مايع زجاجیه میزان بیاان کريساتالین بیشتر بوده و در غلظت 31 درداد دافیه سایاه باود و اثاری از رنگپذيری سلولها ديده نشد. در حالیکه در غلظتهای زير 21 دردد اندک رنگی در نواحی روئیت شده بود ( شثل 1 (. 11

A B C D شثل 1: بررسی ايمنوسیتوشیمی بیان آلفا کريستالینها در سلولهای گاروه کنتارل )A( پاس از 32 روز کشات بادون مجااور باا ماايع زجاجیاه کاه هیچگونه سیگنالی مبنی بر بیان کريستالینها را نشان نمیدهد. در سلولهای بنیادی گروه تجربای ماايع آمنیوتیاک )B( و بافات چربای )C( کاه تیات القای 21 دردد مايع زجاجیه نسبت به مییط کشت پس از 32 روز بوده اند و بیاان آلفاا کريساتالینهاا باا رناگ سابز مشااهده مایشاود و همچناین سلولهای بنیادی مغز استخوان )D( که تیت القا 33 دردد مايع زجاجیه نسبت به مییط کشت به مد با رنگ سبز قابل روئیت است. )بزرگنمايی 411( 32 روز قرار گرفتند و بیان آلفاا کريساتالینهاا بحث جداسازی و تلوص سلولهای بنیادی مزانشیمی ماوش باهعلات تعداد کم سلولهای مزانشیمی در مغز استخوان و رشد ناتواسته سلولهای غیرمزانشیمی بهمراتب مشثل تار از ديگار گوناههاای جاانوری اسات )31(. سالولهاای مغاز اساتخوان شاامل فیبروبالستها سالولهاای اجادادی تاونی )35( ماکروفاكهاا سلولهای اندوتلیالی و چربای مایباشاند )32(. مطالعاا قبلای نشان دادند اين سلولها در کشت باقی مانده و باعق آلودهسازی سلولهای فیبروبالستی میشوند )33 و 41 (. اما تعاويض میایط کشت مانع از چسبیدن سلولهای غیار مزانشایمی و تاونی باه پلیت پالستیثی کشت میشود. در اين مطالعاه بادون کمتارين استرس برسلولها و با بهبود روش چسابیدن باه ظار پالستیک از طريق تعويض سريع مییط کشت در ساعا کشات اولیه از کشت سلولهای مغز استخوان موش از چسبیدن سلولهای غیر مزانشیمی به ظر کشت جلوگیری گرديد. سالولهاای بنیاادی مشتق شده از بافت چربی سلولهايی هستند که چند توان بوده 11

و از نوع بنیادين باال مایباشاند )43(. ايان سالولهاا همانناد سلولهای بنیادی مغز استخوان به ک ظر پالساتیثی کشات مایچسابند و از لیااظ بررسای مارکرهاا حادودا مشاابه عمال میکنند. اين سلولها نسبت به مارکرهاای ساطیی سالولهاای تونساز منفی عمل کارده و نسابت باه مارکرهاای سالولهاای بنیادی مزانشیمی ميبت هستند )44(. در تیقیقا گذشته نشان داده شد که سلولهای بنیاادی ماايع آمنیوتیاک در مقايساه باا سلولهای بنیاادی مغاز اساتخوان قادر تثيیار و تودناوزايی بااالتری دارناد )41 و 42 (. در ايان مطالعاه نیاز تثيیار بااالی سلولهای بنیادی مايع آمنیوتیک در مقايسه باا سااير سالولهاا مويد مطالعا میققین قبلی بود. يثی ديگر از روشهای شناسايی اين سلولها اساتفاده از ماارکر ساااطیی اسااات. Baddoo و همثاااارانش )43( مارکرهاااای سطیی CD48 CD105 CD34 CD11b CD81 CD106 و CD31 را در سلولهای بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش بررسی کردند که نتايج اين بررسی نشان داد کاه ايان سالولهاا مارکرهای CD106 CD105 و CD81 را به میزان بااليی بیاان کردند در حالیکه مارکرهایCD11b CD45 CD48 CD34 و CD31 به میزان کمی بیان شدند. مطالعا انجام شاده نشاان میدهد که سلولهای بنیادی مزانشیمی مشاتق شاده از بافات چربی مارکرهای سطیی متفاوتی مانند CD44,CD54,,CD29, CD73 (SH3), CD90, CD105 (SH2), CD106, CD146, CD166 را بیان میکنند ولای فاقاد مارکرهاای ديگاری مانناد CD14, CD31, CD34, CD45, CD133, CD144, HLA- STRO-1 DR, میباشاند. آناالیز فلوساايتومتری از مارکرهاای سطیی سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان و بافت چربی نشان داده است که اين سلولها مارکرهاايی مانناد CD13, CD29, CD44, CD90, CD105 (SH2), CD73 (SH3), را بیان می کنند در حالیکه اين سلولها بیان متفااوتی از CD49d, CD54, CD34 دارناد.)41( You و همثاارانش )45( بر روی سلولهای بنیادی مايع آمنیوتیک انسانی مارکرهای سطیی CD29 و CD31 و CD45 را بررسی کردند کاه نتاايج اين بررسی نشان داد که اين سلولها مارکرهای CD29 را بیاان میکنند اما CD31 و CD45 بهمیزان تیلی کم بیان مایکنناد. Liu و همثارانش )42( مطالعاهای بار روی سالولهاای بنیاادی مزانشیمی مايع آمنیوتیک موشی انجام دادند که مشخص شد که اين سلولها فیبروبالستی شثل مارکر CD44 را بیان مایکنناد اما مارکرهای CD31 CD90 و CD45 را بیان نمیکنند. در اين مطالعه بیان برتای مارکرهاای ساطیی نظیار CD31 و CD90 در سلولهای بنیادی مزانشایمی مغاز اساتخوان بافات چربی و مايع آمنیوتیک به روش فلوسیتومتری مورد بررسی قرار گرفت که نتايج اين تیقیاق نشاان داد کاه سالولهاای بنیاادی مزانشایمی مغاز اساتخوان و ماايع آمنیوتیاک ماارکرCD90 را بهمیزان کم بهترتیب 43/43 دردد و 1/35 دردد بیاان کردناد اما سلولهای بنیادی مزانشیمی بافت چربی اين مارکر را بهمیزان باال بهمقدار دقیق 24 دردد بیان کردند. بیاان ماارکر CD31 در بافتهای چربی مغزاستخوان و مايع آمنیوتیاک باه ترتیاب 1/3 دردد 1/22 دردد 3/31 دردد میباشد که نشانگر بیان اندک اين مارکر در سلولهای بنیادی هر سه منبع است. بیان CD90 و CD31 در سلولهاای بنیاادی مزانشایمی ماايع آمنیوتیک آنقدر اندک اسات کاه عماال موياد عادم بیاان ايان مارکرهاست. اين نتايج در راستای مطالعا میققین قبلی اسات کاه سالولهاای بنیاادی مزانشایمی ماايع آمنیوتیاک را فاقاد مارکرهای CD90 و CD31 میدانند. در اين تیقیق توانايی تمايز سلولهای بنیاادی مزانشایمی مغاز استخوان بافت چربی و مايع آمنیوتیک به سلولهای فیبر عدسی چشم بررسی گرديد. به اين منظور سلولهای مزانشایمی از مغاز استخوان بافت چربی و مايع آمنیوتیک موش جدا شد و بهماد 32 روز باا ماايع زجاجیاه چشام گااو تیماار شاد. Eleanor و همثارانش )43( بر روی رشد و تماايز سالولهاای اپایتلیاومی عدسی انسان مطالعه کردند. آنها اين سلولهای اپایتلیاومی را جدا کارده و باهماد 33 روز در میایط دارای FGF-2 کشات دادند. در نهايت مشاهده کردند که مورفولوكی آنها تغییر يافتاه و اجسام لنتوئیدی (lentoid) )مجموعه دستجا چناد سالولی گرد و دارای تادیت انثسار باال( ظاهر شدند. آنها بارای اثباا ادعای تود در مورد تمايز اين سلولها به عدسی چشم از ماارکر آلفا کريستالینها با روش RT-PCR استفاده کردند. در تیقیاق حاضر سلولهای بنیادی مزانشیمی کاه باهماد 32 روز تیات القای مايع زجاجیه چشم قرار داشتند از نظر بیان آلفا کريستالین توسط روش ايمونوسیتوشیمی مورد بررسی قرار گرفتند که پاسخ ميبت اين سلولها بیانگر تمايز آنها بهسمت ايجااد سالولهاای فیبر عدسی و بیان كنهای تاص عدسی میباشد. Michael و همثارانش )11( دو بافت اپایتلیاومی از دو عدسای مجزا را بر روی هم در مییط کشت مخلاو باا زجاجیاه گااوی )3:3( کشت دادند و عالوه بر بررسیهای میثروسثوپی و تعیاین 19

میزان توانايی اين ساتتار عدسی مانند نشان دادند کاه در ايان شرايط اين سلولها بعد از 11 روز کشت شثلی مشابه سلولهای فیبر عدسی پیدا کرده و شفا شده اند و قادر به متمرکز کاردن نور گرديدهاند. در نتیجه مايع زجاجیه گاوی فاکتورهای مناساب برای تمايز به سمت سلولهای عدسی را داراست. در تیقیق حاضر از مايع زجاجیه چشم گاو باا دوزهاای متفااو استفاده شد. بررسیهای مورفولوكيثی نشان داد که در سلولهای گروه تجربی مایتاوان تغییارا قابال مقايساهای را نسابت باه گروههای کنترل مشاهده کرد. تغییارا مورفولاوكيثی مشااهده شده در اين تیقیق عبارتند از کشیدگی زياد سلولها بهماوازا هم قرارگیری آنها افزايش تعاداد هساتکهاا و از دسات دادن هسته سلولی که همه اين نتايج مورفولوكيثی بیانگر شروع تماايز اين سلولها بهسمت ساتتارهای شبه فیبر عدسی بوده و با نتايج Michael و همثارانش مطابقت دارد. ملثی و همثارانش )13( سلولهای بنیادی بند نا موش سوری را جدا کرده و در مجاور مايع زجاجیه چشم گاو کشت دادند و بیاان پاروتئینهاای کريساتالین α A و α B را بعاد از 32 روز کشات در دوز 43 درداد باا اساتفاده از روش Western blot analysis مشاهده نمودند. در مطالعهی حاضر دوزهای مختلفی از مايع زجاجیه باا میایط کشت آماده گرديد تا روند تاثیرگاذاری میازان زجاجیاه بار القاا سلولی مشخص گردد. اين دوزها در ابتدا از 31 دردد شروع شد اما چون نتیجهی مطلوب حادل نشد و مرگ و میر سلولی بسیار باال بود در نتیجه میزان دوز از 31 دردد آغاز گرديد که در ايان روند با بررسی کامل سلولهای تیات القاا سالولهاای بنیاادی مزانشیمی مايع آمنیوتیک و بافت چربی مارکر کريساتالینهاا را در دوز 21 دردد و سلولهای بنیادی مزانشیمی مغاز اساتخوان در دوز 33 دردد بیان کردند. در اين بررسی ديده شد که در دوز 31 دردد مرگ میر سلولی بسیار باال باود. ايان مطلاب نشاان دهندهی کشنده بودن مايع زجاجیاه در غلظاتهاای بااال بارای سلولها میباشد. اين نتايج همانند کار ملثی و همثارانش )13( نشان دادند کاه تیات القاا فاکتورهاای رشاد موجاود در ماايع زجاجیه چشام سالولهاای بنیاادی مزانشایمی مشاتق از مغاز استخوان بافت چربی و مايع آمنیاون مایتوانناد باه سااتتاری مشابه به فیبر عدسی تمايز يابناد کاه در هار دو تیقیاق ماارکر تمايزی آلفا کريستالین بیان شدند. بیاان آلفاا کريساتالینهاا در انواع مختل سلولهای بنیادی تیت القا دوزهاای متفااو مايع زجاجیه حاکی از توان تمايزی متفاو سلولهای بنیادی گرفته شده از منابع متفاو میباشد. نتیجه گیری در کل از يافتههای اين تیقیق می تاوان نتیجاه گرفات کاه بار اساس تغییرا مورفولوكيثی و بیاان مارکرهاای تااص عدسای سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان بافات چربی و مايع آمنیوتیک در اثر تیمار باا زجاجیاه تاوان تماايز در جهات تشاثیل سالولهاای فیباری عدسای را دارناد. تخلایص سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان بهعلت هتروكن بودن نسبت به بافت چربی و مايع آمنیوتیاک از مزيات کمتاری بارای کشات برتاوردار اسات و از طار ديگار تثيیار سلولهای مايع آمنیوتیک بسیار باالتر از دو بافت ديگر است اماا با توجه به اينکه سلولهای بنیادی مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان در دوز پايینتری نسبت به دو بافات ديگار القاا شادند بافت مناسبتری مایباشاند. باا توجاه باه ويژگایهاای مشاابه سلولهای موش و انسانی میتوان امیادوار باود کاه سالولهاای بنیادی انسانی نیز اين قابلیت را داشته باشند که در ايانداور میتوان از اين سلولها در درمان بیماریهاای چشامی اساتفاده کرد. تخلیص سلولهايی با منشاهای متفاو موجب میشاود تاا دست میققان و پزشثان در امر درمان بازتر باشاد تاا اگار تهیاه سلول از يک بافت با مشثل مواجه شد امثان جايگزينی باا روش مناسب تر را داسته باشند. تشکر و قدرداني از همثاری آقای دکتر امیر آتشی مدير گروه سلولی شرکت بن ياتته و همچنین مساعد نمودن دانشگاه علوم پزشثی ايران و انستیتو پاستور ايران جهت انجام آنالیز فلوسايتومتری دمیمانه سپاسگزاری مینمايیم. منابع 1. Baksh D, Davis JE, Zandstra PW. Adult human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells are capable of adhesion-independent survival and expansion. J ISEH. 2003; 31: 723-732. 2. Ulloa-Montoya F, Catherine M.Verfaillie and Wei-shou Hu. Culture systems for Pluripotent Stem Cells. JBioscience and bioengineering. 2005; 100: 12-27. 22

3. Musina RA, Eqorov EE, Beliavski AV. Stem cells:properties and perspectives of therapeutic use. J Mol Biol(mosk). 2004; 38: 563-77. 4. Friedenstein AJ, Petrakova KV. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. J.Embryol. J exp. Morph. 1966; 16(3): 581-390. 5. Baghaban Eslaminejad MR, Taghiya L. Mesenchymal Stem Cell Purification from the Articular Cartilage cell culture. J Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 2007; 10: 146-153. 6. Alexanian Arshak R. Neural stem cells induce bone- marrow-derived mesenchymal stem cells to generate neural stem-like cells via juxtacrine and paracrine interactions.j xperimental Cell Research. 2005; 310(2): 383-391. 7. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. J Science. 1999; 284(5411): 143-7. 8.Oyser Clyde W. The human eye: structure and function. Published by Sinauer Associates,Inc. 1999; 530-531. 9. Majima K. Presence of growth factor in human vitreous. J Ophthalmologica. 1997; 211(4): 226 228. 10. McAvoy JW. Beta- and gamma-crystallin synthesis in rat lens epithelium explanted with neural retinal. J Differentiation. 1980; 17 (2):85 91. 11. Zhao H, Rossant J, Ornitz DM, Beebe DC, et al. Different FGFR genes play an essential but redundant role in postinduction lens development. Invest Ophthalmol Visual Sci. 2003; 44: 954-963. 12. Bloemendal H, de Jong W, J aenicker, Lubsen NH, et al. Ageing and vision :structure,stability and function of lens crystallines. J Prog. Biophys. Mol. Biol. 2004; 86(3): 407-485 13. Horwitz J. Alpha -Crystallin can function as a molecular chaperone. Proc.Natl.Acad.Sci. USA.1992; 89(21): 10449-1045. 14. BehfarA, Yamada S, Crespo-Diaz R, NesbittJJ, et al. Guided Cardiopoiesis Enhances Therapeutic Benefit of Bone Marrow Human Mesenchymal Stem Cells in Chronic Myocardial Infarction. Am Coll Cardiol. 2010; 56: 721-734. 15. Pitchford SC, Hahnel MJ, Jones CP, Rankin SM. Troubleshooting: Quantification of mobilization of progenitor cell subsets from bone marrow in vivo. J Pharmacological and Toxicological Methods. 2010; 61(2): 113 121. 16. Eslaminejad MB, Nikmahzar A, Taghiyar L, Nadri S, et al. Murine mesenchymal stem cells isolated by low density primary culture system. Dev Growth Differ. 2006; 48: 361-70. 17. Phinney DG, Kopen G, Isaacson RL, Prockop DJ. Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variations in yield, growth, and differentiation.. J Cell Biochem. 1999; 72(4): 570-85. 18. Zuckerman KS, Wicha MS. Extracellular matrix production by the adherent cells of long-term murine bone marrow cultures. J Blood. 1983; 61(3): 540-7. 19. Meirelles Lda S, Nardi NB. Murine marrowderived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 2003; 123(4): 702-11. 20. Xu CX, Hendry JH, Testa NG, Allen TD. Stromal colonies from mouse marrow: characterization of cell types, optimization of plating efficiency and its effect on radiosensitivity. J Cell Sci.1983; 61: 453-66. 21. Ian Freshney R, Stacey Glyn N, Auerbach Jonathan M. Culture of human stem cells. chapter 13: Tissue culture of adipose derived stem cells. J Wiley-Interscience. 2007; 304-305. 22. Lidong G, Shaoqing LI, Yunfang W, Huimin Y, et al. In vitro differentiation of human adiposederived mesenchymal stem cells into endotheliallike cells. Chinese Science Bulletin. 2006 ; 51(15): 1863 1868. 23. Zheng YB, Gao ZL, Xie C, Zhu HP, et al. Characterization and hepatogenic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic fluid and human bone marrow: a comparative study. Cell Biol Int. 2008; 32: 1439-1448. 24. Nadri s, Soleimani M. Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from murine bone marrow and amniotic fluid.cytotherapy 2007; 9(8): 729-737. 25. Baddoo M, Hill K, Wilkinson R, Gaupp D, et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 2003; 89(6): 1235-49. 26. De Ugarte DA, Alfonso Z, Zuk PA, Elbarbary A, et al. Differential expression of stem cell mobilizationassociated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunol Lett. 2003; 89(2-3): 267-270. 27. You Q, Cai L, Zheng J, et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid.int J Gynaecol Obstet. 2008 ; 103: 149-152. 28. Liu ZSh, Xu YF, Feng ShW, Li Y, et al. Baculovirus transduced mouse amniotic fluidderived stem cells maintain differentiation potential. Ann. Hematol.2009; 88: 565-572. 21

29. Eleanor AB, Kathleen AB, Polly YC, McNamara Morgan P, et al. Growth and differentiation of human lens epithelial cells in vitro on matrix. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 2000; 41(12): 3893-3907. 30. Connor O, Michael D, W.Acavoy J. In vitro generation of function lens-like structures with relevance To age-related nuclear cataract. Invest ophthalmol Vis Sci. 2007; 48 (3):1245-1252. 31. Maleki M, Kazem P, Nabiyouni M, Parichehr Y, et al. Induction of Alpha-Crystallins Expression in Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells. Iranian Journal of Ophthalmology. 2010; 22(2): 67-71. 22

Journal of Cell & Tissue (JCT) Spring 2014; 5(1): 11-22 Original Article Characterization and Lens Fiber like Cells Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Adipose Tissue and Amniotic Fluid: A Comparative Study Mohseni kouchesfehani H, Ph.D. 1*, Nabiuni M, Ph.D. 2, Eslami N, MD. 3, Bahrebar KH, MD. 3, Gheibi P, MD. 3 1. Department of Animal Biology, Faculty of Biology Science, kharazmy University, Tehran, Iran, 1571914911 2. Department of Cell & Molecular, Faculty of Biology Science, kharazmy University, Tehran, Iran, 1571914911 3. Master of science, Department of Animal Biology, Faculty of biological Science, kharazmy University, Tehran, Iran, 1571914911 * Email corresponding author: kouchesfehani@yahoo.com Received: 2 Jan. 2013 Accepted: 14 Jan. 2014 Abstract Aim: In this study the effect of vitreous humor on the mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow, adipose tissue and amniotic fluid to lens like cells was investigated. Material and methods: Inthis experimental study collected stem cells from femurs bone marrow and inguinal fat pads of mature NMRI mice and amniotic fluid of 13 days embryos of NMRI mice were cultured. The mesenchymal character of these cells was proven by flow cytometry markers like CD90, CD31. This experiment took place for 14 days with different dosages 10, 15, 20, 30, 40, 50 % of bovine vitreous humor. Express of crystalline markers were detected by immunocytochemistry in experimental and control groups. Results: The flow cytometeric analyses of surface markers were shown expression of CD90 by bone marrow and amniotic fluid stem cells and adipose tissue stem cells (29/29%, 0/57%, 82%, respectively). Moreover, mesenchymal stem cells from these 3 sources had expression of CD31 (3/44%, 1/53%, 0/1%, respectively). Immunocytochemistry results revealed that 40 % vitreous humor in culture media fluid more inducing effect on adipose and amniotic fluid mesenchymal stem cells and 15 % vitreous humor on bone marrow stem cells in order to differentiate. Conclusion: According to the findings of this study, it can be concluded that MSCs derived from all sources can differentiate into lens fiber like cells by inducing effect of vitreous humor. Keywords: Mesenchymal Stem Cells, Vitreous Body, Crystalline 121 Journal of Cell & Tissue, Spring 2014, 5(1)